一、产品基本信息
| 项目 | 内容 |
|---|---|
| 产品名称 | 2‘,7’-二氯荧光素二乙酸酯 |
| 英文名称 | 2‘,7’-Dichlorodihydrofluorescein diacetate |
| 中文别名 | H2DCFDA、DCFH-DA、2‘,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯 |
| CAS号 | 4091-99-0 |
| 分子式 | C₂₄H₁₆Cl₂O₇ |
| 分子量 | 487.28 g/mol |
| 外观 | 白色至类白色结晶粉末 |
| 纯度 | ≥98%（HPLC） |
| 溶解性 | 溶于DMSO（250 mg/mL）、无水乙醇、DMF；微溶于水 |
| 激发/发射波长 | 氧化产物DCF：Ex/Em = 502/523 nm（最大） |
| 储存条件 | -20°C冷冻保存，避光防潮，惰性气体保护 |
| 用途 | 活性氧（ROS）荧光探针，用于细胞内ROS检测、氧化应激评估、药物筛选、流式细胞术、荧光显微镜 |
二、产品简介与核心优势
H2DCFDA（2‘,7’-二氯荧光素二乙酸酯）是检测细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）水平最经典、应用最广泛的荧光探针，由美国国家卫生研究院（NIH）的Bass等科学家于1983年首次报道并推广。该探针被公认为氧化应激检测的“金标准”工具，被数万篇SCI论文引用。
H2DCFDA本身不具有荧光，且具有良好的细胞膜透过性。其检测原理基于两步反应：首先，H2DCFDA进入细胞后，被细胞内的酯酶水解，脱去二乙酸酯基团，生成带负电荷的H2DCF（2‘,7’-二氯二氢荧光素）。由于H2DCF带有电荷，无法自由通过细胞膜，因此在细胞内被有效“捕获”和积累。随后，细胞内的活性氧（包括过氧化氢、羟基自由基、过氧亚硝酸盐等） 将还原型无荧光的H2DCF氧化，生成高荧光的DCF（2‘,7’-二氯荧光素）。通过荧光显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪检测DCF的荧光强度，即可定量评估细胞内活性氧的整体水平。
相比于传统的电子自旋共振（ESR）等物理检测方法，H2DCFDA/CM-H2DCFDA探针具有操作简便、灵敏度高、可高通量检测、成本适中等显著优势。改进型的CM-H2DCFDA探针在此基础上增加了氯甲基基团，使其能更好地与细胞内谷胱甘肽或其它巯基发生反应，从而具有更好的细胞内滞留性，特别适合相对较长时间的研究或后续的固定、透化与免疫标记实验。
核心优势：
- 经典可靠、文献海量：自1983年建立以来，已有数万篇SCI论文引用，是氧化应激检测的金标准，实验方法成熟，结果可比性强
- 高灵敏度、快速响应：可检测低至纳摩尔级别的ROS水平变化，探针进入细胞后30分钟即可完成染色
- 细胞膜透过性极佳：二乙酸酯形式使其轻松穿越细胞膜，在细胞内被酯酶水解后“捕获”，背景信号低
- 操作简便、高通量适配：无需裂解细胞，仅需在细胞孔板中加入稀释好的探针与细胞共同孵育即可进行检测，适合96/384孔板高通量筛选
- 多重检测兼容性：可与Hoechst等核染料、PI等死细胞染料、MitoTracker等线粒体探针联合使用，实现多参数同时分析
- 仪器兼容性强：可用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜直接观察，或用流式细胞仪、荧光分光光度计、荧光酶标仪定量检测
三、检测原理
H2DCFDA的荧光反应基于细胞内的两步转化过程：
Step 1：酯酶水解——细胞内的“捕获”
- H2DCFDA（无荧光，亲脂性）自由穿过细胞膜
- 进入细胞后，胞内非特异性酯酶水解二乙酸酯基团
- 生成H2DCF（2‘,7’-二氯二氢荧光素）——带负电荷、无荧光、不能穿过细胞膜
- H2DCF在细胞内积累，背景信号极低
Step 2：ROS氧化——荧光“开启”
- 细胞内活性氧（ROS）将还原型H2DCF氧化
- 生成DCF（2‘,7’-二氯荧光素）——高荧光产物
- 氧化程度与细胞内ROS水平成正比
Step 3：荧光检测
- 激发波长：502 nm（最大）（488 nm激光常用）
- 发射波长：523 nm（最大）（FITC通道检测）
- 荧光强度直接反映细胞内活性氧水平
H2DCFDA对多种ROS敏感，可被多种活性氧氧化，包括：过氧化氢（H₂O₂）、羟基自由基（·OH）、过氧亚硝酸盐（ONOO⁻）、次氯酸（HOCl）等。值得注意的是，超氧阴离子（O₂•⁻）和一氧化氮（NO）本身不能直接氧化H2DCFDA，但可转化为其他ROS间接氧化。
反应特点：
- 反应特异性强，仅活细胞可完成水解和氧化两步反应
- 荧光信号扩增效应显著，灵敏度极高
- 背景极低：未水解的H2DCFDA无荧光，水解后的H2DCF在被氧化前也无荧光
- 适合活细胞实时动态监测
四、主要应用领域
4.1 细胞内活性氧（ROS）水平检测（核心应用）
H2DCFDA是检测细胞内整体氧化应激水平最常用的荧光探针，被广泛用于评估各种内外源刺激对细胞氧化状态的影响。
应用场景：
- 外源刺激对ROS的影响：检测紫外线、电离辐射、化学药物、纳米材料、环境污染物等对细胞ROS水平的诱导作用
- 内源氧化应激变化：检测基因过表达/敲低、细胞因子刺激、炎症激活等引起的ROS变化
- 细胞表型与ROS关联研究：评估干细胞衰老、肿瘤细胞代谢重编程、免疫细胞活化等过程中的氧化还原状态变化
4.2 抗氧化剂活性筛选与药物开发
在药物开发中，H2DCFDA是抗氧化剂活性评估和ROS调节药物筛选的核心工具。
检测流程（96/384孔板高通量模式）：
- 细胞接种于微孔板
- 加入候选化合物预处理
- 加入H2DCFDA探针（5-10 μM），孵育30分钟
- 加入阳性诱导剂（如H₂O₂、甲萘醌、罗苏普（Rosup））刺激ROS产生
- 荧光酶标仪实时或终点检测
应用场景：
- 天然产物（植物提取物、中药单体）抗氧化活性筛选
- 新型合成化合物ROS调节效应评估
- 线粒体靶向抗氧化剂研发
- 电离辐射防护剂筛选
4.3 流式细胞术高通量检测
H2DCFDA与流式细胞术兼容性极佳，可在单细胞水平高通量、多参数评估ROS水平。
实验流程：
- 细胞悬液（如免疫细胞、血细胞、悬浮细胞系）
- H2DCFDA染色（1-10 μM，30分钟，37°C）
- PBS洗涤2次去除多余探针
- 流式细胞仪检测（488 nm激发，FITC通道530 nm检测）
- 阳性对照：甲萘醌（Menadione）100 μM处理1小时或H₂O₂ 100-500 μM处理30分钟
- 阴性对照：未染色细胞（设置细胞自发荧光基线）
流式结果：Mean Fluorescence Intensity（MFI）反映群体平均ROS水平；阳性细胞百分比反映ROS升高细胞亚群比例。
4.4 荧光显微镜与高内涵成像
H2DCFDA可用于荧光显微镜下的细胞ROS分布可视化和高内涵成像系统的自动化分析。
实验流程：
- 细胞接种于盖玻片或成像培养板
- H2DCFDA染色（5-10 μM，30分钟，37°C）
- 洗涤后加入药物或阳性对照刺激
- 荧光显微镜观察（488 nm激发，525 nm发射，FITC通道）
- 注意：在完全培养基中荧光信号较弱，建议在HBSS或PBS缓冲液中进行成像；必须设立阳性对照确认染色体系有效
成像特点：
- DCF绿色荧光分布于细胞质，反映胞浆ROS水平
- 可结合Hoechst 33342等核染料复染细胞核
- 可与PI（碘化丙啶）联用，区分坏死/凋亡细胞
4.5 组织切片氧化应激检测
H2DCFDA可应用于新鲜冰冻组织切片中ROS水平的半定量检测，在动物模型研究中具有应用价值。
应用场景：
- 脑缺血再灌注模型中梗死区ROS水平评估
- 肝脏毒性模型中各区带氧化应激差异检测
- 炎症组织中ROS分布定位研究
注意事项：仅适用于新鲜组织，固定的组织酯酶失活，无法水解探针，不适用于此方法。
五、H2DCFDA vs. 其他ROS检测探针：对比分析
| 对比项 | H2DCFDA（本品） | CellROX™ Green | Dihydroethidium |
|---|---|---|---|
| 检测对象 | 广义ROS | 广义ROS | 超氧阴离子特异性 |
| 激发/发射（nm） | 502/523 | 485/520 | 490/585（氧化产物） |
| 染色后是否需要洗涤 | 是（降低背景） | 否（可在完全培养基中标记） | 是 |
| 完全培养基兼容性 | 否（必须在HBSS/PBS中成像） | 是 | 是 |
| 固定后兼容性 | 否（固定前必须成像） | 是 | 否 |
| 信号强度 | 强 | 很强 | 较强 |
| 主要应用 | 常规ROS检测、高通量筛选 | 活细胞与固定细胞ROS成像 | 超氧阴离子特异性检测 |
选择建议：
- 常规ROS检测、高通量筛选、药物评估：首选H2DCFDA，性价比高，文献海量
- 完全培养基中直接成像、需固定后分析：选择CellROX™ Green / Deep Red
- 超氧阴离子特异性检测：选择Dihydroethidium（DHE）
六、实验方案
6.1 储存液配制
10 mM DMSO储存液（推荐浓度）：
- 称取5 mg H2DCFDA粉末，加入1.026 mL DMSO（计算依据：[5 mg] / [487.28 g/mol] ≈ 10.26 μmol，10.26 μmol / 1.026 mL = 10 mM）
- 涡旋混匀，确保完全溶解
- 分装至无菌EP管中（建议每管5-10 μL，避免反复冻融）
- 用铝箔纸包裹避光
- 储存条件：-20°C长期保存（可稳定保存6-12个月）
注意事项：
- DMSO应选用高纯度、低水分的细胞培养级DMSO
- DMSO具有吸湿性，使用新开封的DMSO效果最佳
- 储存液在-20°C避光条件下可稳定保存，但应避免反复冻融
- 储存液若变为绿色或棕色表明已氧化降解，不可使用
6.2 贴壁细胞H2DCFDA染色流程（荧光显微镜 / 荧光酶标仪）
试剂准备：
- 10 mM H2DCFDA储存液
- 活细胞成像用HBSS（Hanks’ Balanced Salt Solution）或PBS（不含酚红）
- 阳性对照试剂：H₂O₂（100-500 μM）或甲萘醌（100 μM）
- 阴性对照：未染色细胞（细胞自发荧光）
染色流程：
第一天：细胞接种
- 96孔板每孔接种0.5-2×10⁴个细胞（100 μL培养基），过夜培养至细胞贴壁良好
- 或24孔板（盖玻片）接种2-5×10⁴个细胞，用于显微镜观察
第二天：染色与刺激
- 药物预处理（如需）：加入待测化合物，处理适当时间（30分钟至24小时）
- 探针装载：吸弃培养基，用HBSS或PBS洗涤1次（去除血清干扰），每孔加入100 μL HBSS（含5-10 μM H2DCFDA，1:1000-1:2000稀释储存液），37°C孵育30分钟，避光
- 洗涤去背景：吸弃探针溶液，用HBSS或PBS洗涤2次（每次5分钟）
- 刺激诱导：每孔加入含待测诱导剂（药物、H₂O₂等）的新鲜HBSS或不含酚红的培养基，37°C孵育15-60分钟（根据ROS产生速率优化）
- 阳性对照：H₂O₂（100-500 μM）或甲萘醌（100 μM）处理30-60分钟
检测：
- 荧光酶标仪：检测激发502 nm / 发射523 nm荧光强度，计算荧光增强倍数或ROS抑制率
- 荧光显微镜：FITC通道观察，DCF绿色荧光分布于细胞质
- 流式细胞术（悬浮细胞）：按悬浮细胞流程操作
数据分析：
- 相对ROS水平（%） = （实验组荧光强度 - 空白组）/（对照组荧光强度 - 空白组）× 100%
- ROS抑制率（%） = [1 - （实验组 - 空白组）/（阳性诱导组 - 空白组）] × 100%
6.3 悬浮细胞H2DCFDA染色流程（流式细胞术）
染色流程：
- 细胞收集：离心收集细胞（2-5×10⁵个样品），重悬于PBS或HBSS
- 探针装载：加入H2DCFDA至终浓度1-10 μM（常用2-5 μM），37°C避光孵育30分钟
- 洗涤：加1 mL PBS，离心（300 g，5分钟），吸弃上清，重复2次
- 刺激与诱导：重悬于含待测药物的PBS或培养基中，37°C孵育15-60分钟
- 流式检测：488 nm激光激发，530 nm（FITC通道）检测FL-1荧光强度
- 数据分析：计算Mean Fluorescence Intensity（MFI）或ROS阳性细胞百分比
6.4 染色条件优化指南
| 参数 | 推荐范围 | 优化建议 |
|---|---|---|
| 探针浓度 | 1-10 μM | 从2-5 μM开始摸索；背景高则降低浓度；信号弱则增加浓度 |
| 装载时间 | 15-60分钟 | 常用30分钟；时间过长可能导致细胞毒性 |
| 装载温度 | 37°C | 不可室温（酯酶活性低） |
| 诱导时间 | 15-120分钟 | 根据ROS产生速度优化；H₂O₂ 15-30分钟；甲萘醌30-60分钟[min] |
| 阳性对照 | H₂O₂（100-500 μM）或甲萘醌（100 μM） | 必须设立，确认染色体系有效 |
| 阴性对照 | 未染色细胞、未刺激细胞 | 必须设立，设置基线 |
6.5 注意事项
必须设立对照：
- 阴性对照：未染色细胞（检测细胞自发荧光）
- 阴性对照：染色未刺激细胞（检测基础ROS水平）
- 阳性对照：染色+阳性诱导剂（验证染色体系有效性）
细胞密度优化：
- 96孔板：每孔0.5-2×10⁴个细胞（贴壁），1-5×10⁵个细胞/mL（悬浮）
- 保证对照组荧光强度在背景值的2-10倍之间
- 细胞过密可能导致接触抑制，影响ROS反应
血清干扰问题：
- H2DCFDA染色不能在完全培养基中进行，需在HBSS或PBS中进行
- 血清中的酯酶会水解探针，导致高背景和信号假象
- 装载后必须充分洗涤，去除残留探针
溶剂注意事项：
- DMSO对细胞有一定毒性，染色时储存液稀释倍数应≥1000倍（终浓度DMSO <0.1%）
- DMSO浓度过高可能引起细胞应激和ROS升高假象
- 建议设立溶剂对照组（含相同浓度DMSO的空白处理）
染色后洗涤：
- 装载后必须充分洗涤2次以上，否则未进入细胞的探针会产生非特异性背景荧光
- 洗涤步骤不可省略
避光操作：
- H2DCFDA和已染色细胞对光敏感，实验全程注意避光（可用铝箔包裹容器）
七、产品质量标准
湖南汇百益新材料有限公司提供的H2DCFDA产品严格执行以下质量标准：
| 检测项目 | 质量指标 |
|---|---|
| 外观 | 白色至类白色结晶粉末 |
| 纯度（HPLC） | ≥98.0% |
| 分子式 | C₂₄H₁₆Cl₂O₇ |
| 分子量 | 487.28 |
| 溶解性 | 250 mg/mL溶于DMSO，溶液澄清 |
| 干燥失重 | ≤1.0% |
| 游离DCF | ≤0.5% |
| 细胞ROS检测 | 符合检测标准 |
湖南汇百益通过优化合成工艺与精制技术，将产物纯度稳定控制在≥98%（HPLC检测），严格控制游离DCF含量（≤0.5%），确保检测的背景值低、灵敏度高。产品批间稳定性良好，适合科研及试剂盒的规模化生产。
储存稳定性：
- 粉末在-20°C避光干燥条件下可稳定保存2年
- DMSO储存液在-20°C避光条件下可稳定保存6-12个月
- 产品对光敏感，储存和工作液均应严格避光
- 储存液若变为绿色或棕色表明已降解，不可使用
八、供应商介绍：湖南汇百益新材料有限公司
湖南汇百益新材料有限公司（原湖南韵邦生物医药有限公司）成立于2014年，位于怀化市洪江循环高新产业园区，拥有50,000平方米生产基地。公司是一家专注于生物基础试剂研发、生产与销售的“国家高新技术企业”、“湖南省专精特新企业”，拥有独立研发试验中心和生产基地，并已通过ISO 9001:2015质量管理体系认证。公司严格按照国际标准，不断完善硬件设施与质控流程，构建了全方位覆盖的精控生产体系，核心产品IPTG、DTT等高端生物原材料，质量已达国际先进水平。
公司先后获得“怀化市工程技术研究中心”“湖南师范大学化学生物学功能材料产学研基地”“创新创业大赛湖南省优秀企业”“湖南新材料企业”等一系列荣誉称号。
依托强大的生产平台与技术实力，公司可灵活提供OEM代工服务与个性化定制方案，如提纯、精制加工等，以满足客户多元化需求。旗下品牌“汇百试剂”，通过提供性能稳定可靠、品质媲美进口、成本更具优势的国产试剂，为生物医药、体外诊断、生物工程及科研机构等领域的客户提供基础材料解决方案，以实现关键生物基础试剂国产化替代与关键试剂本土化供应，切实解决中国生物试剂的供应瓶颈问题，并持续助力科研突破与产业创新升级。
通过多年的努力，公司已建成完善的营销网络，辐射海内外市场，产品远销至东南亚、欧美等多个国家和地区，得到全球客户的认可和信赖。公司始终秉承“诚信务实、开拓创新”的企业宗旨，竭诚为客户提供优质的产品和服务，真诚期待与国内外客户携手并进、合作双赢、共创辉煌。
公司研发、生产、销售各种高纯生化试剂，包括：
- 糖苷系列：IPTG、ONPG、PNPG、DTT、x-gal、x-gluc、D-荧光素钾盐等
- 生物缓冲剂：Tricine、HEPES、MOPS、CAPS、TAPS、MES、BES等
- 检测试剂：ABTS、TMB、TMB-PS、鲁米诺、异鲁米诺、WST-8、PMS、X-Gluc、H2DCFDA等
- 高纯生化试剂：DEPC、异硫氰酸胍、PMSF、BSA等
湖南汇百益提供的H2DCFDA产品具有以下突出优势：
- 高纯度：HPLC纯度≥98%，游离DCF含量≤0.5%，检测背景极低
- 细胞ROS检测验证：产品经细胞实验验证，阳性对照（H₂O₂/甲萘醌）荧光信号显著升高
- 现货供应：常备库存，支持快速发货，满足紧急实验需求
- 规格灵活：提供从毫克级到克级（10 mg、25 mg、50 mg、100 mg、500 mg等）的产品
- 专业包装：采用避光、密封、防潮包装，惰性气体保护，-20°C冷冻运输保存
- 技术支持：专业技术团队提供全程使用指导与问题解答
- 源头工厂：自产自销，具备价格优势和供应稳定性
九、采购与使用建议
在采购H2DCFDA（CAS 4091-99-0）时，建议重点关注以下几点：
- 纯度要求：对于细胞ROS检测等敏感实验，建议选择纯度≥98%的产品，游离DCF含量应≤0.5%，以确保检测的低背景和高灵敏度。
- 游离DCF含量验证：优质的H2DCFDA应严格控制游离DCF含量，这是评价产品背景值的关键指标。游离DCF高会直接产生荧光信号，导致假阳性。
- 溶解性验证：产品应在DMSO中完全溶解，250 mg/mL浓度下溶液应澄清透明，无不溶物。
- 阳性对照验证：新批次首次使用时，建议用H₂O₂（100-500 μM）或甲萘醌（100 μM）处理细胞30-60分钟，确认阳性对照荧光信号比阴性对照升高2-10倍。
- 储存条件：-20°C冷冻保存，避光防潮，建议在惰性气体保护下保存。粉末在-20°C可稳定保存2年。
- 分装建议：DMSO储存液建议按单次用量分装（5-10 μL/管），-20°C避光保存，避免反复冻融。解冻后一次性使用。
- 批间一致性：对于标准化实验流程和高通量筛选，选择具备严格质量控制体系的供应商。
- 使用注意事项：
十、联系我们
如需获取H2DCFDA（CAS 4091-99-0）的产品报价、样品或技术支持，请联系湖南汇百益新材料有限公司：
- 产品咨询：13319523173
- 订购邮箱：ivy@hnhbsj.com
- 官方网站：https://www.hbsjxcl.com/
- 公司地址：湖南省怀化市洪江区工业园8号
声明：本产品仅供科研使用，不用于临床诊断或治疗。使用前请仔细阅读产品说明书，并遵守实验室安全操作规范。
本文由湖南汇百益新材料有限公司提供，数据来源于内部质检标准及公开行业研究资料。
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