二氢乙锭 DHE

二氢乙锭（Dihydroethidium，DHE） 是一种细胞膜渗透性的荧光探针，其本身呈现微弱的蓝色荧光。该探针能够自由扩散进入活细胞，在细胞内主要与超氧阴离子（O₂•⁻） 发生特异性氧化反应，脱氢后生成乙锭（Ethidium）或其羟基化产物2-羟基乙锭（2-OH-E⁺），该产物随后嵌入细胞核DNA中，发出强烈的红色荧光。

作用机制与光谱特性

DHE在未氧化状态下，最大激发波长为370 nm，最大发射波长为420 nm（蓝色荧光）。被超氧阴离子氧化并与DNA结合后，荧光光谱发生显著红移。其氧化产物2-羟基乙锭的荧光激发波长约为396 nm，发射波长约为590-610 nm。在实际操作中，也可使用518-535 nm作为激发波长，在610 nm附近检测红色荧光信号。

DHE对超氧阴离子的反应速率常数约为2 × 10⁶ M⁻¹s⁻¹，具有较好的反应灵敏度。需要注意的是，DHE也可被过氧化氢（在过氧化物酶存在下）或其他氧化剂氧化产生乙锭，因此在数据分析时，通过高效液相色谱（HPLC）分离并定量2-羟基乙锭，是提高超氧阴离子检测特异性的推荐方法。

核心应用领域

1. 细胞内超氧阴离子检测
DHE是检测活细胞、组织切片中超氧阴离子水平最常用的荧光探针之一。DHE被活细胞摄入后，在超氧阴离子作用下脱氢生成乙锭，乙锭与RNA或DNA结合产生红色荧光。细胞内超氧阴离子水平越高，红色荧光越强，据此可进行定性定量分析。该探针可直接用于活细胞标记，给予均匀的细胞染色通常在30-40分钟内完成。

2. 血管与组织氧化应激研究
DHE广泛应用于血管组织中活性氧的原位检测与成像。在颈动脉、主动脉等血管样本中，DHE染色结合荧光显微镜分析，可用于评估NADPH氧化酶等来源的超氧阴离子产生水平。在肾脏、脑等组织切片中，DHE同样可用于定量和定位氧化应激区域，评估疾病模型中的氧化损伤程度。

3. 线粒体超氧阴离子检测
通过对DHE进行结构修饰（连接三苯基膦阳离子），可开发出靶向线粒体的超氧阴离子探针MitoSOX™ Red。该探针可选择性进入线粒体基质，被线粒体内的超氧阴离子氧化后发出红色荧光，用于监测线粒体氧化应激水平。

4. 流式细胞术与高通量检测
DHE兼容流式细胞仪、荧光酶标仪及激光共聚焦显微镜等多种检测平台。在流式细胞术中，DHE可用于评估细胞群体中活性氧的分布与异质性；在微孔板格式中，DHE可用于高通量筛选抗氧化剂或评估化合物对细胞内氧化应激的影响。此外，DHE还可与JC-10等探针联合使用，实现线粒体膜电位与活性氧的双参数同时检测。

产品优势与使用须知

DHE具有细胞膜渗透性好、反应灵敏度高、操作便捷等特点。其本身为蓝色荧光，氧化后转为红色荧光，信噪比优良，适用于活细胞成像与流式分析。

储存与使用建议：DHE对光和空气敏感，建议在-20°C避光、惰性气体（氩气）条件下储存，以防氧化为乙锭。工作液通常以DMSO配制，推荐使用浓度为1-10 μM，在37°C避光孵育15-30分钟。染色后可用Triton X-100裂解细胞以增强荧光信号。

特异性控制：由于过氧化氢在过氧化物酶存在下也可氧化DHE，建议在关键实验中结合HPLC分离2-羟基乙锭，或使用超氧化物歧化酶（SOD）作为阴性对照，以确认荧光信号确实来源于超氧阴离子。