潮霉素B在生物领域应用与使用说明

潮霉素B通过抑制蛋白质合成而杀死细菌、真菌和高等真核细胞。通过干扰70S核糖体易位和诱导对mRNA模板的错读而抑制蛋白合成，从而杀死原核（如细菌）、真核（如酵母菌，真菌）和高等哺乳动物真核细胞。目前常用于筛选和维持培养含潮霉素抗性基因的原核或真核细胞。潮霉素B可溶于甲醇、乙醇和水，但在乙醚、氯仿或苯中都几乎不溶。

潮霉素B（Hygromycin B）是由吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，大肠杆菌（ Escherichia coli.）来源的潮霉素抗性基因（hyg或hph），编码潮霉素B磷酸转移酶，将潮霉素B转化成不具有生物活性的磷酸化产物，从而起到解毒作用。针对这一原理，潮霉素B是一种非常有用的选择性标记，用来筛选和维持培养成功转染潮霉素抗性基因的原核或者真核细胞。另外，由于作用模式的差异，常与G418 (GeneticinTM)，Zeocin™ 和Blasticidin S联合使用进行双抗性阳性细胞株的选择。潮霉素B还能用作抗病毒剂，因其选择性渗透进入因病毒感染增强通透性的细胞，且具有抑制翻译的功效。还可混合入动物饲料中起到驱虫功能。

潮霉素B在20世纪50年代被发现，当时用作动物用药。而现在它仍然作为驱虫抗虫药被加入鸡和猪的饲料中。用于产生潮霉素的吸水链霉菌在1953年被首次从土壤中分离并获得纯培养。潮霉素B相关的抗性基因发现于20世纪80年代早期。

抗性基因：对潮霉素B的抗性源自编码潮霉素B磷酸转移酶（Hph）的基因。至今发现两种来源。
i.Streptomyces hygroscopicus产生的Hph抗性基因；
ii.Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae内质粒携带的Hph抗性基因（常用）。

二、潮霉素B的应用
  1.筛选和维持培养稳定转染Hph 载体的原核细胞或真核细胞（植物细胞和哺乳动物细胞）；
  2.由于作用模式的差异，常与G418 （GeneticinTM），Zeocin™和blasticidin S联合使用，筛选稳定转染两个不同载体的细胞株；
  3.抗病毒剂，由于潮霉素B选择性渗透进入因病毒感染增强通透性的细胞，而且具有抑制翻译的功效；
  4.作为驱虫药加入动物饲料；
  5.双抗性稳定转染细胞筛选的抗生素作用机制及抗性
  6.抗生素抗性机制抗性基因哺乳动物筛选浓度
   i.潮霉素B干扰70S核糖体易位和诱导对mRNA模板的错读Hph 200~500μg/mL；
   ii.G418干扰80S核糖体功能和抑制蛋白合成Tn5/Tn60 1100~1000μg/mL；
   iii.Zeocin掺入或者切割DNA引起细胞死亡Sh ble 50~100μg/mL；
   iv.blasticidin S核糖体上抑制肽键形成Bsd/BSD 3~50μg/mL。
  7.罗氏潮霉素B应用浓度
   潮霉素B用来筛选稳转株的工作浓度需要根据细胞类型，培养基，生长条件和细胞代谢率而变化。推荐使用浓度为50-1000 μg/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定。
   i.哺乳动物细胞·200-500 μg/mL；
   ii.细菌/植物细胞·100-300 μg/mL；
   iii.真菌·300-1000μg/mL。

三、潮霉素B的使用步骤

  1.案例一：杀灭曲线确定最佳杀死浓度（仅作参考）
   i.往组织培养级的96孔板内加入未转染细胞，细胞密度约50-200细胞/孔；细胞贴壁之后，往每孔加入含不同浓度（如50-1000μg/mL，至少5个浓度）潮霉素B的200μL新鲜培养基；
   ii.37℃，5% CO2培养箱孵育细胞10-14天；
   iii.培养5-7天后更换新的培养液，培养液内含有相应浓度的潮霉素B；
   iv.10-14天后使用细胞增殖方法如MTT，CCK-8等评估细胞活力；也可以通过检测细胞克隆数或百分比汇合率来确定毒性效应。一般选择在10-14天能够杀死所有细胞的最小浓度为最佳筛选浓度。

  2.案例二：筛选稳定转染细胞
   i.对于贴壁细胞，直接吸去60mm培养皿内的转染细胞培养基，然后加入含有潮霉素B的新鲜培养基5-6ml；对于悬浮细胞，无菌条件250x g,离心10min除去旧的转染细胞培养基，然后悬浮在约5ml的含潮霉素B的新鲜培养基；
   ii.5-7天后，如上方法更换含有潮霉素B的新鲜培养基；
   iii.再孵育细胞5-7天；
   iv.10-14天孵育后，培养体系中只含有能够表达潮霉素B抗性表型的活细胞。因此筛选之后如步骤一，更换不含潮霉素B的新鲜培养基。

四、保存方法：

溶液直接存放在2℃～8℃，至少存放1年。

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