X-Gal与X-α-gal有什么不同？二者可以互相替换吗？

　　X-Gal与X-α-gal有什么不同？二者可以互相替换吗？

　　X-Gal是E.coliβ-半乳糖苷酶（LacZ）的反应底物，而X-α-gal是酵母α-半乳糖苷酶（MEL1）的反应底物。X-α-gal用作酵母双杂交系统中蓝白筛选的筛选标记。二者不可以互相替换。

　　X-α-Gal检测酵母MEL1基因的激活。MEL1是GAL4酵母双杂交系统的一个报告基因，编码分泌型的α-半乳糖苷酶。该酶可水解无色的X-α-Gal底物并最终产生蓝色产物。表达α-半乳糖苷酶的酵母菌落在含有X-α-Gal的培养基上显蓝色，即阳性的双杂交作用。X-α-Gal可在培养基上直接检测酵母双杂交相互作用，利用此底物可以省去双杂交体系中的β-半乳糖苷酶溶液和filter-liftassays；

　　X-Gal用于检测β-半乳糖苷酶（LacZ）的活性。由于β-半乳糖苷酶不能分泌，需裂解酵母细胞后通过加入β-半乳糖苷酶溶液和filter-liftassays才能进行显色。因此操作流程相对繁琐。

　　携带MEL1基因的酵母菌株：Y2HGold、Y190、AH190、Y187、PG69-2A

　　1、X-α-gal使用方法

　　一、涂布于预制平板：

　　1）溶解24mgX-α-gal于6mLDMF，终浓度为4mg/mL。

　　2）涂布200μL(15cm) 或者100μL（10cm）X-α-gal储存液于预制平板上；

　　3）置于37℃培养箱至液体被吸收（由于DMF挥发性低，最长可放4小时）；

　　4） 将转化细菌或酵母涂于平板上，于37℃或30℃培养直至蓝色菌落出现。

　　二、直接加入琼脂中：

　　1）溶解60mgX-α-gal于3mLDMF，终浓度为20mg/mL。

　　2）将已灭菌琼脂培养基冷却至50-55℃；

　　3）向上述培养基中加入20mg/mLX-α-Gal，比例为每升培养基中加入1mLX-α-Gal溶液。

　　2、X-gal使用方法（filter-liftassays）

　　试剂准备

•        Z buffer
  

　　16.1g/L   Na2HPO4·7H2O

　　5.50g/L   NaH2PO4·H2O

　　0.75g/L   KCl

　　0.246g/L  MgSO4·7H2O

　　调节pH7.0，高温高压灭菌。可室温保存。　

　　20mg/mLX-gal储液（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside），溶于DMF，保存于-20。

• 　　Z缓冲液/X-gal溶液
  

　　100mL     Zbuffer

　　1.67mL   X-gal 储液

　　0.27mL    β-mercaptoethanol

　　实验流程

　　1.生长2-4天的新鲜单菌落;用铅笔在滤纸上画8×8的方格，每个方格放置一个新鲜培养的单菌落并记录下编号;

　　2. 配制Zbuffer/X-gal反应液;

　　3. 在干净平皿中铺一张滤纸，用Zbuffer/X-gal反应液(2.5-5mL)将滤纸浸湿;

　　4.用镊子另取一张无菌、干燥的滤纸，铺在划线培养的酵母菌表面，用镊子轻轻滚压，使菌转移到滤纸表面(注:在滤纸上做好方位标记，以便识别菌种编号);

　　5.当滤纸全部湿润，用镊子将铺有菌落的滤纸放入液氮中速冻30sec，液氮需没过菌落;

　　6. 取出滤纸，放置于一干净平皿中使其室温解冻;

　　7.用镊子将解冻的滤纸轻轻叠放在浸有反应液的滤纸上(有菌的表面朝上)，保证两层滤纸间没有气泡;30°C，培养8h，观察X-gal染色情况。菌落变为蓝色的为阳性，超过8h变蓝，很有能是假阳性。

　　注意事项：

　　1.x-gal注意遮光保存。

　　2.液氮冰冻菌的时候可以试试反复冻融，这样会使细胞破碎的更加完全一些，便于染色液的渗透。