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IPTG诱导蛋白不成功,一般来说是受到了一些实验因素的影响,如果我们能够优化这些影响因素,那么就能获得高质量的重组蛋白。
纵观重组蛋白诱导表达过程,重组蛋白表达的影响因素分为以下三点:
①诱导时间:E.coli扩大培养之后,通过检测OD600来判断菌体数量,从而确定IPTG加入菌体开始诱导。在菌体生长的对数早期进行诱导,菌体数量较少,表达量有限;在对数晚期进行诱导,由于营养的消耗和代谢物的积累,菌体生长受到抑制,表达量下降,故一般在OD600=0.6~0.8开始诱导为佳。当然,加入诱导剂后的表达时间也需要摸索。
②诱导温度:温度与细菌生长速率相关,较高温度,细菌生长速率较高,导致发酵过程中代谢物大量积累,对细菌的生长与目的蛋白表达产生抑制,所以一般都是采取低温(16~25℃)诱导。
③IPTG的浓度。一方面,IPTG竞争性地与阻遏蛋白结合从而启动目的蛋白的转录,若IPTG浓度过低则达不到与lac阻遏蛋白结合的饱和浓度,从而不利于诱导蛋白表达;另一方面,过高浓度的IPTG会促进包涵体(IB)的形成。包涵体是指由于细菌内蛋白量太高,使得细菌蛋白质质量控制系统应接不暇,部分折叠与未折叠的蛋白分子聚集成团,很难溶解,影响蛋白质量。
那么,低温诱导蛋白表达时用多少度合适呢?举个例子,当IPTG 浓度时0.1mM 诱导时间一般24个小时 如果是冷休克载体的话是15度诱导,不同的宿主和载体可能略有差异 可以以上面数据为基点,做个一定范围的探索。
湖南汇百益专注IPTG、ONPG、PNPG、MOPS等糖苷系列、生物缓冲剂系列、诊断试剂系列、高纯生化试剂系列等原材料的研发、生产和销售,源头工厂,现货现发,如有相关需求,欢迎致电:13319523173!
IPTG诱导蛋白不成功,一般来说是受到了一些实验因素的影响,如果我们能够优化这些影响因素,那么就能获得高质量的重组蛋白。
纵观重组蛋白诱导表达过程,重组蛋白表达的影响因素分为以下三点:
①诱导时间:E.coli扩大培养之后,通过检测OD600来判断菌体数量,从而确定IPTG加入菌体开始诱导。在菌体生长的对数早期进行诱导,菌体数量较少,表达量有限;在对数晚期进行诱导,由于营养的消耗和代谢物的积累,菌体生长受到抑制,表达量下降,故一般在OD600=0.6~0.8开始诱导为佳。当然,加入诱导剂后的表达时间也需要摸索。
②诱导温度:温度与细菌生长速率相关,较高温度,细菌生长速率较高,导致发酵过程中代谢物大量积累,对细菌的生长与目的蛋白表达产生抑制,所以一般都是采取低温(16~25℃)诱导。
③IPTG的浓度。一方面,IPTG竞争性地与阻遏蛋白结合从而启动目的蛋白的转录,若IPTG浓度过低则达不到与lac阻遏蛋白结合的饱和浓度,从而不利于诱导蛋白表达;另一方面,过高浓度的IPTG会促进包涵体(IB)的形成。包涵体是指由于细菌内蛋白量太高,使得细菌蛋白质质量控制系统应接不暇,部分折叠与未折叠的蛋白分子聚集成团,很难溶解,影响蛋白质量。
那么,低温诱导蛋白表达时用多少度合适呢?举个例子,当IPTG 浓度时0.1mM 诱导时间一般24个小时 如果是冷休克载体的话是15度诱导,不同的宿主和载体可能略有差异 可以以上面数据为基点,做个一定范围的探索。
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①诱导时间:E.coli扩大培养之后,通过检测OD600来判断菌体数量,从而确定IPTG加入菌体开始诱导。在菌体生长的对数早期进行诱导,菌体数量较少,表达量有限;在对数晚期进行诱导,由于营养的消耗和代谢物的积累,菌体生长受到抑制,表达量下降,故一般在OD600=0.6~0.8开始诱导为佳。当然,加入诱导剂后的表达时间也需要摸索。
②诱导温度:温度与细菌生长速率相关,较高温度,细菌生长速率较高,导致发酵过程中代谢物大量积累,对细菌的生长与目的蛋白表达产生抑制,所以一般都是采取低温(16~25℃)诱导。
③IPTG的浓度。一方面,IPTG竞争性地与阻遏蛋白结合从而启动目的蛋白的转录,若IPTG浓度过低则达不到与lac阻遏蛋白结合的饱和浓度,从而不利于诱导蛋白表达;另一方面,过高浓度的IPTG会促进包涵体(IB)的形成。包涵体是指由于细菌内蛋白量太高,使得细菌蛋白质质量控制系统应接不暇,部分折叠与未折叠的蛋白分子聚集成团,很难溶解,影响蛋白质量。
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纵观重组蛋白诱导表达过程,重组蛋白表达的影响因素分为以下三点:
①诱导时间:E.coli扩大培养之后,通过检测OD600来判断菌体数量,从而确定IPTG加入菌体开始诱导。在菌体生长的对数早期进行诱导,菌体数量较少,表达量有限;在对数晚期进行诱导,由于营养的消耗和代谢物的积累,菌体生长受到抑制,表达量下降,故一般在OD600=0.6~0.8开始诱导为佳。当然,加入诱导剂后的表达时间也需要摸索。
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②诱导温度:温度与细菌生长速率相关,较高温度,细菌生长速率较高,导致发酵过程中代谢物大量积累,对细菌的生长与目的蛋白表达产生抑制,所以一般都是采取低温(16~25℃)诱导。
③IPTG的浓度。一方面,IPTG竞争性地与阻遏蛋白结合从而启动目的蛋白的转录,若IPTG浓度过低则达不到与lac阻遏蛋白结合的饱和浓度,从而不利于诱导蛋白表达;另一方面,过高浓度的IPTG会促进包涵体(IB)的形成。包涵体是指由于细菌内蛋白量太高,使得细菌蛋白质质量控制系统应接不暇,部分折叠与未折叠的蛋白分子聚集成团,很难溶解,影响蛋白质量。
那么,低温诱导蛋白表达时用多少度合适呢?举个例子,当IPTG 浓度时0.1mM 诱导时间一般24个小时 如果是冷休克载体的话是15度诱导,不同的宿主和载体可能略有差异 可以以上面数据为基点,做个一定范围的探索。
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